大蛇丸一度走近被打到城楼面上的第三代，称对其表示失望，第三代亦一度因为想起童年的大蛇丸而流泪起来。但不久日斩重拾战意，以敏捷的身手攻击大蛇丸，猿魔亦从如意棒中把手伸出、企图勒死大蛇丸。大蛇丸及时化为泥泞躲避猿魔的攻击，并向日斩展示自己脸皮底下的第二真面目--就是利用“不死转生”、而成功侵占肉体的年轻女忍者面孔。
大蛇丸表示这只是他第二次转生的容器，而下一个目标就是拥有写轮眼的宇智波佐助。 日斩引爆初代及第二代身上的引爆符，以顺利阻止两者的攻击，然而他们“秽土转生”的肉体可立即修补过来。
修复身躯后的两名火影，即对爱徒继续攻击。初代使用木遁术欲再抓击日斩，但幸亏猿魔化成“金钢牢壁”及时保护他。
初代亦使用“幻术·黑暗行之术”(动画为二代使用)，将日斩封锁在黑暗环境当中，并对日斩展开攻击。 双方对战 由于此时的日斩年迈体衰，实力已不如全盛时期这么厉害，因此，日斩只好使用禁术尸鬼封尽，随后，日斩使用两个影分身将初代火影和二代火影封印，由自己的本体封印大蛇丸，但由于在封印过程中，日斩不幸被大蛇丸操纵草锥剑从背后插入，迫使日斩无力将大蛇丸的灵魂抽出，因此日斩决定利用死神将大蛇丸双手废掉，使大蛇丸永远不能结印以使用忍术。
日斩对大蛇丸痛斥道：“你沉溺于忍术，为忍术而自傲，这样的惩罚才最适合你，我要夺走你所有的术。”
决意使用禁术尸鬼封尽 因为日斩深信木叶“火之意志”一定会继承下去，所以在倒下时仍带着微笑、及再次看到童年的大蛇丸，接着便一睡不起。
他的通灵兽猿魔因为失去召唤者亦瞬间消失了，大蛇丸也因失去战斗力、在音忍四人众保护下撤退。 当一众木叶忍者赶到时，他被发现躺在城楼上，带着安详的模样离世。
后来他的葬礼由自童年时一起的队友水户门炎及转寝小春所主持，而全村均进入一片哀悼中下忍们亦纷纷回想起曾跟第三代一起的有趣经历，但想想 更觉得悲伤，惟有在他陵前献上一朵鲜花，以代表对死者最后的祝福。
微笑离世 第四次忍界大战 在第四次忍界大战中，大蛇丸获取漩涡一族收纳堂的死神面具